20. HPLC System

 

1.       HPLC의 개요.
화합물은 구조에 따라 이동상(용매)과 고정상(column충진제)과의 화학적 결합에 차이가 있으며 흡착, 분배, 이온교환 등에 따라 분리되는 정도가 다르므로 이러한 성질을 이용하여 혼합물 중의 단일성분을 분리, 정제 및 정성, 정량분석이 가능하다.
액체를 이동상으로 사용하는 경우를 액체 크로마토그래피라 한다. 액체 크로마토그래피는 화합물의 분자량에 제한이 없으며 시료회수가 용이하다. 이러한 액체 크로마토그래피는 분리 효율을 더욱 높이기 위해 고안된 장치가 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)이다. 즉, HPLC system에서는 고정상(column내 충진제)의 입자의 크기를 10 ㎛ 이하의 것을 사용하므로 이동상(solvent)가 흐를 수 있도록 수십기압의 압력을 가하여 물질의 분리할 수 있게 해주는 장치이다.

HPLC system은 이동상(solvent) 저장용기와 기체제거장치(degasser), 펌프(pump), 고정상 (column), 시료주입장치(injector), 검출기(detector), 기록기(recorder)의 기본 장치들로 구성되어 있다.

 

2. HPLC의 장치 구성
2.1 컬럼(column)
    액체 크로마토그래피에서 주로 이용하고 있는 칼럼은 역상 칼럼이다. 역상 컬럼을 사용하면 평형에  

도달하는 시간이 단축되고 원래의 실리카 충진제와 달리 표면의 화학적 성질이 다양해지므로 응용분야가 넓은 특징을 갖고 있다. 역상 충진제는 실리카 담체에 탄화수소을 화학적으로 결합시켜 비극성 충진물을 만들고 메탄올이나 완충용액과 같은 극성용매를 이동상으로 이용하는데 이러한 방식은 순상크로마토그래피 방식을 이용할 경우 실리카에 강하게 흡착되어 버리는 알콜이나 아민류와 같은 극성활성기를 가지고 있는 시료들을 분리할 때 효과적이다.
역상 컬럼을 이용하는 시료는 극성이 매우 큰 수용성일 때 주로 이용하며 대개 물과 유기 용매를 혼합한 용액에 시료를 용해시켜 사용한다. 주로 쓰이는 유기용매가 메탄올과 Acetonitrile이다.

2.2 고정상의 입자 크기와 효율과의 관계
액체 크로마토그래피의 분리도는 고정상의 줄어든 입자 크기로 인해 좋아진다. 만일 용질이 이동상과 고정상 사이에서 빠르게 확산 될 수 있다면 이론단 높이는 감소하고, 주어진 컬럼의 효율은 증가 할 것이다. 그러나 매우 미세한 입자 사용의 단점은 용매 흐름에 대한 저항이다. 그러므로 컬럼을 통하여 액체에 높은 압력을 가해주어야 한다. 흐름속도가 0.5~5mL/min가 되게 하려면 약 7~40Mpa(70~400atm)의 압력이 필요하다. 컬럼과 관련된 연결 부분들은 강한 물질로 보통 스테인레스강으로 만들어 진다.

2.3 정지상
        흔히 사용되는 지지체는 직경 5~10μm의 미공성 실리카 입자이다. 불규칙적인 모양의 입자와 비교

하여, 더 값 비싼 구형 종류는 분리가 더 잘 되며(이론단 높이가 10~20% 작다), 피크가 더 대칭적이고, 컬럼에서 차지하는 이동상의 부피(틈새 부피)가 약 10%작으며, 충전 방법이 더 안정하고, 주어진 흐름속에서 10 ~ 30% 적은 압력을 필요로 한다.

 

2.4 용매
비싼 HPLC 컬럼의 손상을 막기 위해 HPLC에 사용되는 용매는 아주 순수해야 한다. 용매 용기안의 빨아 올리는 관에는 2~5μm보다 큰 먼지를 제거하기 위해 미세한 필터가 연결되어 있다. 압력의 변화나 용매의 혼합으로 생긴 기체 방울은 칼럼이나 검출기의 올바른 작용을 방해한다. 따라서 공기를 빼주거나 끓이거나 용해도가 적은 헬륨 기체를 불어 넣어 주어 크로마토그래피나 용매 공급기로부터 용매에 들어 있는 기체를 빼 주어야 한다. 한가지 용매만 흘려 주는 것을 등용매 분리(isocratic elution)이라 한다. 만일 한 용매가 혼합물중의 여러 성분을 적당히 분리시키지 못하거나 모든 성분을 적당한 빠르기의 속도로 흘려 주지 못하는 경우에는 한 가지 이상의 용매가 사용될 수 있다. 용매 B를 적당한 시간 후에 용매 A와 간단히 바꿀 수 있다. 더욱 일반적으로 기울기 용리(gradient elution)라 불리는 용매의 조성을 계속적으로 바꾸어 주는 방법이 사용된다.

2.5 펌프
펌프의 질은, 얼마나 안정하고 재현성 있는 흐름을 유지하는 가로 측정된다. 어떤 검출기에서는 흐름속도의 요동으로 반응의 요동으로 나타나고 이것이 약한 신호를 파괴하는 노이즈가 된다. LC기기 중 무엇 보다도 중요한 부분은 용매를 일정한 압력으로 컬럼에 보내는 고압펌프이다. 펌프가 갖추어야 할 요건을 간단히 소개를 하면 다음과 같다.
1) 펌프 내부는 용매와의 화학적 상호 반응이 없어야 한다.
2) 최소한 5,000psi의 고압이 가능해야 한다.
3) 유속은 0.5 ~ 10mL/min 정도 조절이 가능하다.
4) 펌프에서 나오는 용매의 공급은 펄스가 없어야 한다.
5) 용매의 유입의 재현성은 1%이내 이어야 한다.
이상의 요건을 가장 만족하는 펌프로서 가장 많이 쓰이는 것이 왕복피스톤펌프이다.

2.6 주입 밸브
교환 가능한 시료 루프는 2~100μ의 고정된 부피를 갖는 좁은 구멍이 뚫린 강철 튜브이다. 펌프에서 칼럼으로의 고압이 흐름이 왼쪽 아래에 있는 밸브 부분을 통과하여 흐른다. 밸브가 시계 방향으로 60o 돌아 가면, 시료 루프 안에 있던 시료가 고압으로 컬럼에 주입된다.

2.7 컬럼 오븐
어떤 경우에는 칼럼을 30oC에서 100oC까지 온도 조절이 가능한 오븐안에 넣기도 한다. 컬럼의 온도가 올라 가면 용매의 점도가 작아져서 주어진 흐름속도를 내는데 더 적은 압력을 필요로 하거나 주어진 압력하에서 유속을 더 빠르게 할 수 있다. 

2.8 검출기
이상적인 검출기는 분석 물질의 낮은 농도에도 감도가 높아야 하며, 분석물질의 넓은 농도 범위에 걸쳐 직선적으로 반응해야 하며(신호가 분석물질의 농도에 비례), 용출되는 피이크의 넓어짐이 적어야 한다. 검출기 안에 기체 방울이 들어가면 노이즈의 원인이 되므로, 용매는 보통 사용하기 전에 탈기 시켜야 한다. 컬럼을 통과한 후에 감소된 압력으로 기체 방울이 생기는 것을 막기 위하여 검출기에도 압력이 걸려야 한다. 시료검출에 쓰이는 검출기로써 많이 이용되고 있는 것이 UV/VIS 검출기이며 이 검출기이외도 형광검출기,굴절율 검출기,전기화학검출기,전도율검출기 등의 기기가 주로 이용되고 있다.

2.8 검출기(계속)

검출기를 이용하여 정량분석을 하고자 할 때에는 얻은 피크의 면적이나 높이로 부터 검량선을 작성한후 시료중의 성분의 함유량을 계산 할 수 있다. 이때 검출기에 의해 작성된 크로마토 그램에서 X축은 검출을 시작한 후 경과된 시간을 의미하고 Y축은 UV/Vis 검출기에 의해서 흡수된 전압(mv)를 의미한다.
                                Schematic Diagram of HPLC

 
1.Eluent, 2.Delivery system and pump, 3.Injecter, 4.Column, 5.Waste, 6.Detector 7.Computer      

 

3.     장치의 용도
유기 화합물의 미량 분석에 이용되며, 금속 이온과 무기 음이온 분석도 가능하다. 특히 아미노산 및 단백질의 분리, 석유 중의 탄화수소의 분리 및 확인, 희토류 원소나 방사성 금속의 분리, 고분자등의 복잡한 물질의 분리 등이 그 예이다. 최근에 와서는 폐수에 잔류하는 유기 독성 물질을 분리하는데 많이 이용되고 있다.


4. D-7000프로 그램 사용법
   컴퓨터의 초기화면에서 D-7000 Manager를 선택하여 실험할 파일을 클릭하면 그전에 실시 했던 실험의 

Run이 화면에 나타나게 된다. 만약 그 전의 실험조건과 동일한 사항에서 실험을 실시 한다면 그대로 이용하면 된다. 새로운 실험 조건이나 또는 그 전의 실험과 상이한 새로운 파일을 생성하려면 다음과 같은 과정을 거치게 된다.

 

4. D-7000프로 그램 사용법(계속)

4.1 Run 파일 만들기
1) 그림으로 표시된 메뉴 중  D-7000 HSM Administrator를 클릭하여, 실험할 파일을 만든 후 D-7000          

HSM Manager를 클릭하여 생성된 파일을 선택한다.

2) 파일에서 New를 클릭한다. 새로 만들기(N)이라는 대화 상자가 나타나면Method를 클릭한다.

3) Method configuration, method information, pump setup, detector setup, calibration method, chromatogram, display format, report format의 여섯 가지의 선택 사항이 나타난다.

4) 위의 항목에 실험 조건을 입력 시킨 후 method를 save한다. Method save 후 다시 file → new →  새로 만들기(N)에서 sample table을 선택한 후 Sample table name을 입력한다.

5) Edit table에서 Vial No., Vol(μ), inj per vial, type, sample name, method name, sample description을 입력 한 후 sample table을 save한다.

6) 시료 분석 전 change application에서 분석할 시료의 파일을 클릭하고, method setup, sampler setup icon을 클릭한 후 acquire data icon을 클릭 하여 baseline이 안정되면 시료 분석을 한다.

4.2 시료 분석 후
시료 분석후 얻어진 data를 “Reprocess data” 파일 내 integration table과 component table를 선택하여 data분석에 적합한 조건들을 입력하여 recalculate한다. 얻어진 modified data와 original data는 report icon을 클릭하여 모니터 화면 또는 인쇄하여 확인 할 수 있다.

5. HPLC실습(예시)
실험결과 첨부