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18. FT-IR Spectrometer

1. FT-IR의 원리.
분자 진동 및 분자 회전은 전자기 스펙트럼의 적외선 영역의 빛을 흡수함으로써 일어난다. 적외부는 가시부의 장파장 쪽에 인접하여 있다. 적외선은 피부에서 따뜻함을 느끼기 때문에 열선이라고도 부른다. 유기분자의 많은 작용기는 IR 스펙트럼의 일정한 부위에 나타나는 흡수대에 상응하는 특징적인 진동을 보여준다. 이러한 분자진동은 그 작용기에 국한하며 분자의 다른 부분과는 상관없다. 따라서 이와 같은 작용기는 그들의 흡수대에 의해서 확인될 수 있다. 이상의 사실과 측정방법이 복잡하지 않다는 점 때문에 적외선 분광법은 임의의 물질이 어떤 특정한 계열의 화합물에 속하는지 알아내기 위한 가장 간단하고, 신속하며 또한 믿을만한 방법이 되고 있다. 대개는 첫눈에 측정물이 알코올인지 아민인지 또는 케톤인지 알 수 있으며, 방향족인지 또는 지방족 화합물인지 알 수 있다. 흡수대의 위치와 강도를 보다 정밀하게 관찰함으로써 매우 다양하고 상세한 사항들을 밝힐 수 있다. 예컨대 방향족의 치환형태, 카르복실산, 에스테르산 및 산 아미드의 존재 등에 관하여 알 수 있다. 뿐만 아니라 근래에는 수 많은 대조 스펙트럼이 카타로그나 데이터 뱅크에 수록되어 있어, 대개는 IR스펙트럼만으로도 미지 물질이 어떤 계열의 화합물에 속하는지 알 수 있다.

2. FT-IR의 장점

1) 측정시간이 신속하여 짧은 시간에도 여러 번 측정을 반복할 수 있슴.
2) 낮은 농도의 시료도 분석이 가능함.
3) 정밀도가 매우 우수.
4) 거울의 속도를 일정하게 유지시키면 분해능은 항상 일정하게 유지됨.
5) 정성 및 정량분석의 정확도가 매우 높음.
6) 고장날 확률도 비교적 낮고 유지하기도 쉬운 편임.
7) 시료의 열분해 또는 변질할 우려가 거의 없슴.

3. 장비의 응용 분야
3.1 물질의 구조 확인
미지의 단일 시료인 경우 도움을 줄 수 있는 여러 가지 실험적 자료(예를 들어 원소 분석, bp, mp, 특수한 화학 시료와의 반응성, NMR, UV-Vis, MS 등의 스펙트럼)를 함께 이용한 다면 물질의 구조를 확인할 수 있고 이물질이 섞여있을 때의 분석이나 Multilayer film를 분 석 할 경우 적당한 방법의 분리를 거치면 분석이 가능하다.

3.2 정성분석
적외선 흡수 스펙트럼을 해석하여 화합물의 구조를 확인하기 위해서는 몇 가지 중요 작용기의 흡수 봉우리의 유무를 결정하는 것이 필요하다. 이런 목적을 위해 화합물의 여러 가지 작용기가 흡수하는 파수 범위에 관한 실험 자료를 종합하여 만든 스펙트럼 일람 도표가 이용된다.

3.3 정량분석 및 순도측정
적외선 분광법에 의한 정량분석은 자외선-가시광선 분광법에서의 방법과 약간 다르다. 적외선 흡수띠는 비교적 좁기 때문에 자외선-가시광선의 경우보다 Beer의 법칙^주⁽¹⁾에서 벗어나는 기기 편차가 크다. 그리고 적외선 분광법에 의한 정량분석은 사용하는 용매에 많은 제한이 있기 때문에 표준 시료의 제조가 용이치 않아 특수한 경우를 제외하고는 별로 사용되고 있지 않지만 이러한 어려운 점을 극복할 수 있다면 자외선 분광법과 같이 정량에 응용될 수 있다. 특히 두 개의 시료가 혼합되어 있을 경우 이들 흡수피크들 중 서로 겹치지 않는 독특한 피크를 표준으로 하여 측정한다면 서로의 혼합비를 알 수 있다. 이러한 원리는 혼합물 중 두 물질의 확인에도 이용될 수 있다. 예로 미반응의 원료나 부산물이 혼합되었을 경우 이들의 순수한 흡수스펙트럼과 혼합 물질의 스펙트럼을 비교해서 각각에 의한 흡수피크가 서로 겹치지 않은 부분의 존재를 통해 혼합물의 단일 성분을 추정할 수가 있다.

^주⁽¹⁾ Beer-Lambert 법칙의 일반식 : A = ε b c, 여기서 c는 용액의 농도이고, b는 빛이 투과하는 셀의 길이, ε는 몰흡수율이다. ( 몰흡수율(ε)은 시료의 성질과 투과하는 빛의 파장에 의존하는 상수) 각 파장(λ)에 대한 빛의 흡광도(A)를 나타낸 그림을 스펙트럼이라 부른다. 셀의 길이 b 와 몰흡수율 ε가 일정한 상태에서 특정 파장에 대한 흡광도는 용액의 농도와 비례한다. 이때 흡광도 A와 c간의 직선적인 비례관계를 Beer-Lambert 법칙 이라 한다.

3.4 반응속도 및 반응과정의 연구
반응물질 및 그 중간체 그리고 최종 생성 물질에 적외선 스펙트럼에서 독특한 흡수 피크를 주는 작용기가 있을 때 이들의 피크의 소멸 및 생성 과정을 추적함으로써 반응의 완결 및 속도, 그리고 그 메카니즘을 측정할 수 있다.

4. FT-IR Spectrometer 사용법

4.1 FT-IR Spectrometer의 전원을 켬.

4.2 “삐”하는 소리가 나면, 컴퓨터를 켬.

4.3 Pellet을 만듬.

1) KBr 시료를 200mg과 (약 10스픈)과 측정 하고자 하는 시료 5mg(약 1/3 스픈)을 혼합.

2) 파우더가 고와지도록 몇분간 갈아줌.

3) Pellet을 만들고자 하는 Sample의 양은 4스픈 정도이다. Pellet이 깨지는 경우에는 셈플양을 더 넣음.

4.4 프로그램을 실행시켜 측정.

1) 바탕화면에 프로그램을 실행 시키고 먼저 Background를 먼저 찍고, 측정하고자 하는 Sample을 찍는다. 이는 공기중의 수분이나 CO₂등의 영향을 고려한 것임.

2) 정 Sample을 넣고 측정 후 file에 저장.

3) 원하는 Working Standard와 측정한 Sample을 불어와서 비교하여 출력.

유의 사항.
1) FT-IR 분광 광도계 주변은 항상 깨끗이 유지하고 어떠한 충격도 가하지 않는다.
2) 박막 시료의 표면을 손으로 만지지 않는다.

3. 참고 문헌 (Reference)

대한약전 제8개정, [일반시험법],<44>적외부스펙트럼측정법

EP 4, <2.2.24> ABSORPTION SPECTROPHOTOMETRY, INFRARED

USP 27, <731> SPECTROPHOTOMETRY AND LIGHT-SCATTERING

JP XIV, <23> INFRARED SPECTROPHOTOMETRY

4. 절 차 (Procedure)

4.1 시험기구 및 시약(Apparatus & Reagent)

IR, 유압 프레스, 막자사발, KBr pellet die, Pike horizontal ATR, Pellet holder,

Vacuum pumps and compressors

4.2 시험준비(Preparation)

1) IR본체의 파워 스위치를 켠 다음 IR에서 비프 음이 들리면 컴퓨터의 스위치를 켠다.

2) 질소 가스를 열어두어 IR본체 내의 습기 및 CO₂ 가스를 제거 시킨다.

4.3 시험방법(Testing Method)

4.3.1 KP Method

1) 시험 원리 및 이론(Testing principle and theory)

적외부스펙트럼측정법은 적외선이 검체를 통과할 때 흡수 또는 투과되는 정도를 각 파수에 대하여 측정하는 방법이다. 적외부스펙트럼은 보통 가로축에 파수를, 세로축에는 투과율이나 흡광도를 표시한 그래프로 나타낸다. 흡수피크의 파수 및 투과율(또는 흡광도)은 그래프상에서 읽거나 데이터처리장치에 의한 산출값을 쓸 수 있다. 적외부스펙트럼의 흡수파수와 그 강도는 대상으로 하는 물질의 화학구조에 따라 정해지므로 물질을 확인 또는 정량에 쓸 수 있다.

4. 절 차 (Procedure)(Continued)

4.3 시험방법(Testing Method)(Continued)

4.3.1 KP Method(Continued)

1) 시험 원리 및 이론(Testing principle and theory)(Continued)

분산형 적외분광광도계 또는 푸리어변환형 적외분광광도계 (Fourier transform infrared spectrophotometer)를 쓴다.

보통 검체의 흡수스펙트럼은 파수 4000 ~ 400 cm^-1에서 측정한다

2) 시험 절차(Testing procedure)

미리 분광광도계를 조정한 다음 분해능, 투과율의 재현성 및 파수의 재현성이 다음 조건에 적합한가를 확인한다. 두께 0.04 mm의 폴리스티렌막의 흡수스펙트럼을 측정하여 얻어진 흡수스펙트럼의 2870 cm^-1부근의 극소와 2851 cm^-1부근의 극대투과율 (%)의 차이가 18% 이상이다. 또한 1589 cm^-1부근의 극소와 1583 cm^-1부근의 극대 투과율 (%)의 차이는 12% 이상이다. 파수의 눈금은 보통 폴리스티렌막의 아래의 흡수대 중에서 몇 개를 써서 보정한다. 다만 괄호안의 값은 이 값의 정확성을 나타낸다.

3027.1 (± 0.3) 1871.0 (± 0.3) 1181.4 (± 0.3) 1028.0 (± 0.3)

2924 (± 2 ) 1801.6 (± 0.3) 1154.3 (± 0.3) 906.7 (± 0.3)

2850.7 (± 0.3) 1601.4 (± 0.3) 1069.1 (± 0.3) 698.9 (± 0.5)

1944 (± 1) 1583.1 (± 0.3)

폴리스티렌막의 3000 ~ 1000 cm^-1에서의 몇 점의 투과율을 2 회 반복 측정할 때 투과율의 차이는 0.5 % 이내, 파수의 차이는 3000 cm^-1부근에서 5 cm^-1,1000 cm^-1부근에서 1 cm^-1이내로 한다.

3) 시험 종류(The sort of testing)

① 브롬화칼륨정제법 또는 염화칼륨정제법

고체검체 1 ~ 2 mg을 마노약절구에 넣고 가루로 하여 브롬화칼륨 또는 염화칼륨 0.1 ~ 0.2 g을 넣어 습기를 흡수하지 않도록 조심하면서 빨리 잘 갈아 섞은 다음 정제성형기로 압축하여 정제로 만든다. 보통 같은 방법으로 대조 브롬화칼륨정제 또는 염화칼륨정제를 만든다. 다만 투명한 정제를 만들 때는 0.67 kPa 이하로 감압하고 정제의 단위면적 (cm²)당 50 ~ 100 kN (5000 ~ 10000 kg)의 압력을 5 ~ 8 분간 가하여 정제로 만든다.

4. 절 차 (Procedure)(Continued)

4.3 시험방법(Testing Method)(Continued)

4.3.1 KP Method(Continued)

3) 시험 종류(The sort of testing)(Continued)

② 용액법

의약품각조에서 규정하는 방법으로 만든 검액을 액체용 고정셀에 넣고 보통 검체의 조제에 쓴 용매를 대조로 하여 측정한다. 또한 이 방법에 쓰는 용매는 검체와의 상호작용 또는 화학반응을 하지 않고 창판을 침식하지 않는 것을 쓴다. 고정셀의 두께는 보통 0.1 mm 또는 0.5 mm로 한다.

③ 페이스트법

고체검체 5 ~ 10 mg을 마노약절구에 넣고 가루로 하여 따로 규정이 없는 한 유동파라핀 1 ~ 2 방울을 넣어 잘 섞어 페이스트를 만든다. 공기가 들어가지 않게 조심하면서 2 장의 창판 사이에 끼워 측정한다.

④ 액막법(液膜法)

액체검체 1 ~ 2 방울을 2 장의 창판 사이에 끼워 측정한다. 액층을 두껍게 할 필요가 있을 때에는 사이띄우개를 2 장의 창판 사이에 끼우고 그 중에 액체검체가 고이도록 한다.

⑤ 박막법(薄膜法)

검체를 박막 그대로 또는 의약품각조에서 규정하는 방법에 따라 박막으로 만든 다음 측정한다.

⑥ 기체검체측정법

검체를 배기시킨 5 또는 10 cm 길이의 광로를 갖는 기체셀에 의약품각조에서 규정하는 압력으로 도입하여 측정한다. 필요하면 1 m 이상의 광로를 갖는 셀을 쓰는 경우도 있다.

⑦ ATR법

검체를 ATR (Attenuated Total Reflectance) 프리즘면에 밀착시키고 그 반사스펙트럼을 측정한다.

⑧ 확산반사법

고체검체 1 ~ 3 mg을 마노약절구로 미세말로 하여 브롬화칼륨 또는 염화칼륨 0.05 ~ 0.10 g을 넣어 습기를 빨아들이지 않도록 조심하여 빨리 잘 섞어 검체접시에 담아 그 반사스펙트럼을 측정한다.

4. 절 차 (Procedure) (Continued)

4.3 시험방법(Testing Method) (Continued)

4.3.2 EP Method

1) 시험 원리 및 이론(Testing principle and theory)

적외선 스펙트럼은 4000cm^-1 ~ 670cm^-1(2.5㎛ ~ 15㎛)의 범위 또는 어떤 경우에는 200 cm^-1(50㎛)까지의 스펙트럼을 기록하는데 사용된다. 푸리어변환형 적외분광광도계 는 다색 방사를 이용하고 푸리어변환으로 얻어진 기초적인 data로부터 주파수 영역을 계산한다. 단색 방사의 영역을 측정할 수 있는 광학적 시스템을 갖춘 spectrophotometer 또한 사용이 된다. 보통 스펙트럼은 투과에 의한 작용, 투과된 후의 강도, 입사의 강도 대한 비율에 따라 달라진다.

흡광도(A) 는 아래의 식과 같이 나타낼 수 있다.

= 입사되는 빛의 강도

= 투과된 후 빛의 강도

2) 분리도의 조정(Control of resolution performance)

0.04mm두께의 폴리스티렌 필름을 시험하여 스펙트럼을 기록한다. 아래 그림과 같이 X 는2870cm^-1 (3.48㎛)에서 최대 투과도 퍼센트A 와 249.5 cm^-1 (3.51㎛)에서의 최소 투과도 퍼센트B의 차이이다. 이값의 차이는 18보다 커야한다.

1589cm-1(6.29㎛)에서 최대 투과도 C와 1583cm-1(6.32㎛)에서의 최소 투과도 D는 12보다 커야 한다.

3) 분리도 조정 절차

표준 스펙트럼의 지시에 따라서 검체의 실험을 준비한다.

작동조건을 이전과 같이 하고 2849.5cm^-1(3.51), 1601.2cm^-1(6.25), 1028.3cm^-1(9.72)에서 검체의 띠들이 폴리스티렌 띠들과 겹쳐지게 하여 스펙트럼을 기록한다.

아래에서 제시된 것과 같이 폴리스티렌 띠들을 비교한다.

폴리스티렌 띠들의 위치를 표준으로 사용하여 중요한 띠들은 검체의 스펙트럼에 나타나야하고 Wave-number scale의 0.5 %안에 값이 나타나야 한다. 상대적인 띠 크기 차이는 일치해야 한다.

4. 절 차 (Procedure) (Continued)

4.3 시험방법(Testing Method) (Continued)

4.3.2 EP Method(Continued)

Typical spectrum of polystyrene used to verify the resolution performance

4) Wave-number scale의 확인(Verification of wave-number scale)

Wave-number scale은 폴리스티렌 필름을 사용한 각각의 wave numbers(in cm ^–¹)에서 최소 투과도(최대 흡광도)로 확인 될 수 있다.

Polystyrene 필름의 최소 투과도(허용오차)

3060.0 (±1.5)cm^-1, 2849.5 (±1.5)cm^-1, 1942.9 (±1.5)cm^-1, 1601.2 (±1.0)cm^-1,

1583.0 (±1.0)cm^-1, 1154.5 (±1.0)cm^-1, 1028.3 (±1.0)cm^-1

5) 시험 절차(Testing procedure)

① 같은 동작조건으로 검체와 표준물질을 같은 절차에 의해 4000 cm^-1에서 670 cm^-1(2.5 ㎛ ~ 12 ㎛ )사이에서 측정하여 그 결과값을 기록한다.

② 스펙트럼에서 최소투과도(최대흡광도)의 값이 다를 경우는 다시 검체와 표준 물질을

같은 방법으로 같은 형태로 만들어 같은 조건에서 실험을 한다.

4. 절 차 (Procedure) (Continued)

4.3 시험방법(Testing Method) (Continued)

4.3.2 EP Method(Continued)

6) 시험 종류(The sort of testing)

① Liquids : 적당한 길이의 경로를 갖는 cell 또는 적외선이 통과하는 2개의 판 사이에 액체 ether를 넣고 적외선이 잘 통과하는지 시험한다.

② Liquids or solids in solution :

적당한 용제의 용액을 준비한다. 만족하는 스펙트럼을 얻기위한 농도와 경로길이를 결정한다. 일반적으로 경로길이 0.1mm 에서 0.5mm까지에 대해서 10g/l 에서 100g/l의 농도가 좋은 결과값을 갖게한다.

③ Solid : 고체를 적당한 액체(mull)를 사용하거나 고체(halide disc)를 사용하여 퍼트린다.

④ Mull : 검체의 작은 량을 빻아서 액체 paraffin이나 다른 적당한 액체를 이용하여 시험한다. 5mg에서 10mg의 검체가 적당한 mull을 만드는데 충분하며 적외선을 통과하는 2개의 판 사이에 mull을 압축한다.

⑤ Disc : 1mg에서 2mg의 검체를 빻아서 고운 가루로된 건조시킨 Potassium bromide 또는 Potassium chloride와 섞어서 300mg ~ 400mg이 되도록 한다. 이 양은 직경 13mm를 disk를 만들기에 충분하다. 주의하여 그 혼합을 빻고 적당한 형틀에 골고루 흩어넣은 후 약800Mpa(8tcm^-2)의 압력으로 Vacuum pumps and compressors을 이용하여 진공상태로 만들고 유압 프레스로 압축시킨다. 과도하게 부수거나 습기가 있거나 혼합물을 흩트릴 때의 다른 불순물들과의 오염을 충분하게 줄이지 못한다면 불량의 디스크를 형성하게 된다. 육안으로 봐서도 투명도가 일정하지 않는 것이 발견되거나 2000cm^-1(5㎛)에서 투과도가 특정한 흡수띠가 없을 때 75%보다 낮게 나온다면 다시 디스크를 만들어야 한다.

4.3.3 USP Method

1) 시험 원리 및 이론(Testing principle and theory)

near-IR 영역은 특히 물과 섞인 알코올, amine류에서 -OH기, tertiary amine의 존재하에서 primary, secondary amine등과 같이 –OH그룹과 –NH그룹들을 결정하는데 적당하다. IR 스펙트럼은 동일한 스펙트럼을 갖는 광학적 이성질체 화학 물질을 제외하고 고유의 IR 스펙트럼을 가진다. 그러나 고체 상태의 화합물의 IR Spectrum 때문에 동질이상이 나타날 수 있는데 종종 구조의 아주 작은 차이가 스펙트럼의 큰 차이를 나타낼 수 있으므로 주의해야 한다.

4. 절 차 (Procedure) (Continued)

4.3 시험방법(Testing Method)(Continued)

4.3.2 USP Method (Continued)

1) 시험 원리 및 이론(Testing principle and theory)(Continued)

IR 영역은 아래와 같다.

NIR(near-IR) : 800 ~ 2500nm(0.8 ~ 2.5㎛)

mid-IR : 2.5 ~ 25㎛ (4000 ~ 400cm^-1)

fir-IR : 25 ~ 400 ㎛

2) 시험 절차(Testing procedure)

① 적외부스펙트럼에서는 적당한 두께에서 완전한 투명함을 갖는 용제가 없으므로 검체를 녹이지 않고 검체를 곱게 갈아서 미네랄 오일에 퍼트리거나 건조시킨alkali halide salt(potassium bromide)를 사용하여 섞어 압축하여 투명한 disk나 pellet 형태로 만들어서 직접적으로 시험에 사용한다.

② 만약 검체가 alkali halide에 영향을 받거나 적절하지 못하다면 mineral oil 퍼트리는 방법으로 실험한다.

③ 검체가 alkali halide에 영향을 받지 않는다면 브롬화칼륨을 105℃, Vacuum상태에서 12시간동안 건조 시킨 후 검체와 섞어 압축하여 깨끗하고 투명하고 얇은 disk나 pellet 형태를 만들어서 즉시 시험에 사용한다.

④ 3800 ~ 650cm^-1(2.5 ~ 15㎛) 영역에서의 값을 측정한다.

4.4 계 산(Calculation)

확인시험

1) 표준품에 의한 확인

검체의 흡수스펙트럼과 표준품의 흡수스펙트럼을 비교하여 스펙트럼이 같은 파수에서 같은 강도의 흡수를 나타낼 때 검체가 표준품과 같은 물질임을 확인한다. 또한 고체검체의 흡수스펙트럼이 표준품의 흡수스펙트럼과 다를 때는 검체와 표준품을 의약품각조의 조건으로 처리한 다음 다시 측정한다.

2) 흡수파수에 의한 확인

확인하고자 하는 물질의 특성 흡수파수가 의약품각조에서 규정하는 흡수파수와 일치하는가를 확인하여 검체가 의약품각조 의약품과 같은 물질임을 확인한다.

5. 절 차 (Procedure) (Continued)

5.4 계 산(Calculation) (Continued)

3) Reference Spectrum을 사용하여 확인 주¹⁾

검체의 흡수스펙트럼과 표준스펙트럼과 비교하여 스펙트럼이 같은 파수에서 같은 강도의 흡수를 나타낼 때 검체가 표준스펙트럼에 명시된 물질임을 확인한다. 또한 고체 검체의 흡수스펙트럼이 표준스펙트럼과 다를 때는 검체와 표준품을 의약품각조의 조건으로 처리한 다음 다시 측정한다.

주¹⁾JP Method